Các loại xe gồm xe máy chuyên dùng có tốc độ thiết kế nhỏ hơn 70 km/giờ, máy kéo, xe môtô hai bánh, xe môtô ba bánh, xe gắn máy (kể cả xe máy điện), các loại xe tương tự, xe máy thi công tự hành, xe bánh xích (trừ xe đang phục vụ việc hoàn thiện các hạng mục còn lại của Đại lộ Thăng Long), xe thô sơ, người đi bộ và súc vật sẽ bị cấm tham gia giao thông trên đường chính đại lộ Thăng Long.

Theo quy định, giao thông trên đại lộ Thăng Long (trên đường chính) theo hai chiều riêng biệt, các xe chỉ được ra, vào đại lộ Thăng Long ở nút giao Trung Hòa, trước và sau nút giao Mễ Trì, trước và sau nút giao ĐT80, nút giao Hòa Lạc.

Tốc độ lưu hành tối đa, tối thiểu cho phép xe cơ giới tham gia giao thông được quy định là: hai làn phía trong (gần dải phân cách giữa) có tốc độ tối đa 80 km/giờ, tối thiểu 50 km/giờ; một làn phía ngoài (gần làn dừng khẩn cấp) có tốc độ tối đa 60 km/giờ, tối thiểu 40 km/giờ. Nếu trời mưa, sương mù hay đường trơn, người lái xe phải giảm tốc độ tùy theo tình hình thời tiết.

Để tổ chức khai thác tạm thời Đại lộ Thăng Long, Phòng quản lý giao thông Đại lộ Thăng Long (Sở Giao thông vận tải Hà Nội) sẽ được thành lập và điều hành, xử lý các tình huống về giao thông xảy ra trên toàn tuyến.

Ngoài ra, tại các vị trí cửa ra vào Đại lộ Thăng Long, lực lượng cảnh sát giao thông và thanh tra giao thông phối hợp với tổ chức khai thác đường thực hiện việc kiểm soát phương tiện để đảm bảo khai thác Đại lộ Thăng Long an toàn.

Quy định cũng nghiêm cấm các hành vi như tự ý đào, đắp mái taluy mở lối lên, xuống cũng như tự ý phá dải phân cách, hàng rào bảo vệ, đắp đất đá hoặc hành vi tương tự để tạo lối đi qua dải phân cách giữa, ra vào đại lộ.

Đối với các hành vi lấn chiếm, trộm cắp, tháo dỡ di chuyển, làm hư hỏng hạng mục trên đường cao tốc gây mất an toàn giao thông, làm giảm tuổi thọ công trình, hạn chế hiệu quả khai thác, tùy theo mức độ vi phạm sẽ bị xử lý hành chính hoặc truy cứu trách nhiệm hình sự.